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電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)
更新時(shí)間：2025-07-24
訪問(wèn)量：517
廠商性質(zhì)：其他
一、電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)技術(shù)原理與生物學(xué)基礎(chǔ)
1. 電穿孔的物理機(jī)制
膜電位改變：短時(shí)高壓電場(chǎng)（通常500–4000 V/cm）使細(xì)胞膜磷脂雙層發(fā)生極化，形成親水性臨時(shí)孔隙（直徑≈10 nm），持續(xù)時(shí)間毫秒級(jí)。
分子遞送機(jī)制：帶負(fù)電的DNA/RNA在電場(chǎng)驅(qū)動(dòng)下以電泳方式穿過(guò)孔隙進(jìn)入胞質(zhì)，后續(xù)依賴細(xì)胞自身機(jī)制擴(kuò)散至核內(nèi)（核膜無(wú)有效電場(chǎng)作用，故“核電轉(zhuǎn)"為偽概念）。
可逆性與安全性：
可逆電穿孔：低強(qiáng)度脈沖后膜修復(fù)完整，細(xì)胞存活率>90%。
不可逆電穿孔：高強(qiáng)度脈沖致膜結(jié)構(gòu)yong久破壞，用于腫瘤消融（非基因操作）。
2. 關(guān)鍵參數(shù)優(yōu)化
| 參數(shù) | 作用 | 典型值 |
|---|---|---|
| 電場(chǎng)強(qiáng)度 | 決定孔徑大小與細(xì)胞存活率 | 哺乳細(xì)胞：100–500 V/cm |
| 脈沖時(shí)長(zhǎng) | 影響分子滲透深度 | 1–10 ms |
| 脈沖波形 | 方波（均一滲透）vs 指數(shù)衰減波（能量漸變） | 方波為主 |
| 緩沖液離子濃度 | 高導(dǎo)電性介質(zhì)增強(qiáng)電流效率，但需避免電解損傷 | 低鹽溶液（如Opti-MEM） |
注：物種差異性顯著，如小鼠受精卵需30V脈沖（3ms時(shí)長(zhǎng)+97ms間隔，7循環(huán)）。
二、電轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)化操作流程
1. 體外電轉(zhuǎn)（以受精卵為例）
樣本制備：
收集受精卵（體內(nèi)/體外受精），用低鹽緩沖液（如Opti-MEM）清洗3次，去除血清干擾。
電轉(zhuǎn)體系構(gòu)建：
將受精卵與目標(biāo)分子（如CRISPR/Cas9核糖核蛋白）混合，置于電轉(zhuǎn)杯或定制電極槽（如LF501PT1-10鉑金電極）。
脈沖施加：
優(yōu)化參數(shù)（如小鼠：30V，3ms脈沖×7循環(huán)），脈沖間隔97ms避免過(guò)熱。
復(fù)蘇培養(yǎng)：
電轉(zhuǎn)后立即用M2培養(yǎng)基清洗，轉(zhuǎn)入KSOM培養(yǎng)液恢復(fù)，37℃/5% CO?孵育至囊胚期。
2. 體內(nèi)電轉(zhuǎn)革新：i-GONAD技術(shù)
原理：跳過(guò)體外操作，直接對(duì)孕鼠輸卵管壺腹部施加電場(chǎng)，轉(zhuǎn)染體內(nèi)受精卵。
流程：
孕鼠麻醉后暴露輸卵管。
注入外源DNA溶液至壺腹部。
定制電極夾住輸卵管施放電脈沖（參數(shù)同體外）。
優(yōu)勢(shì)：
避免體外培養(yǎng)損傷，胚胎存活率提升20%。
已成功應(yīng)用于小鼠、大鼠，潛力擴(kuò)展至豬、猴。
